PCR (research) - applikasjon. Hva er PCR-teknikken?

PCR er en test som har blitt brukt i diagnosen av mange sykdommer. PCR-metoden gjør det mulig å vise direkte tilstedeværelse av bakterier i organismen, og spesielt dens DNA. PCR-testing brukes blant annet i diagnosen Lyme sykdom. Hva er PCR-teknikken? Hva er PCR i sanntid?

Innholdsfortegnelse:

1. PCR (testing) - hva er PCR-teknikken?
2. PCR (research) - anvendelse av PCR-metoden
3. PCR (forskning) - Lyme sykdom
4. PCR (forskning) - resultater. Kan de være falske positive?
5. PCR (forskning) - resultater. Kan de være falske negative

PCR (polymerasekjedereaksjon) er den grunnleggende metoden som brukes i genetiske og molekylære laboratorier. Den ble utviklet i 1983 av Kara Mullis, som ble tildelt Nobelprisen i 1993 for den.

Hør hva PCR-testteknikken handler om. Dette er materiale fra den LYTTENDE GODE syklusen. Podcaster med tips.

For å se denne videoen må du aktivere JavaScript, og vurdere å oppgradere til en nettleser som støtter HTML5-video

PCR (testing) - hva er PCR-teknikken?

PCR-testing består av flere forsterkninger (vanligvis i 30-40 sykluser) av et spesifikt DNA-fragment, f.eks. Gener som koder for Borrelia-proteiner, ved bruk av polymeraseenzymet.

Deretter brukes spesielle molekylære fargestoffer for å synliggjøre det amplifiserte DNA-fragmentet. PCR, på grunn av amplifisering av spesifikke DNA-fragmenter, er en ultrafølsom metode.

I PCR-metoden amplifiseres DNA-fragmenter ved bruk av spesifikke primerpar for en gitt region av det bakterielle DNA. For eksempel er målregioner i PCR brukt i diagnosen Lyme sykdom gener som koder for proteiner, f.eks. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Det biologiske materialet som testen kan utføres fra er:

• blod
• en del av huden fra et vandrende erytem
• cerebrospinal væske
• synovialvæske eller fra leddbrusk
• urin

PCR (research) - anvendelse av PCR-metoden

I tillegg til diagnosen Lyme borreliose ved hjelp av PCR-metoden, er det mulig å oppdage spesifikke DNA-fragmenter av andre mikroorganismer eller mennesker. Derfor brukes PCR-metoden også i:

• diagnose og overvåking av virusinfeksjoner: herpesvirus (herpesvirus, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovirus), HIV, hepatittvirus (HBV og HCV)
• diagnostikk og overvåking av bakterielle infeksjoner, spesielt de bakteriene som ikke kan identifiseres gjennom kulturer, for eksempel tuberkulose
• diagnostikk og overvåking av neoplastiske sykdommer: leukemi, brystkreft, kolorektal kreft, lungekreft
• diagnose av kreft predisponering: bryst- og eggstokkreft (BRCA1 og BRCA2 gener), kolorektal kreft (APC og CHEK2 gener)
• diagnostikk av genetiske sykdommer: hemokromatose (HFE-gen), talassemi (HBA1- og HBA2-gener), cøliaki (HLA-gener)
• farskapstester, som oppdager DNA-kompatibiliteten til barnet og faren

Les også: Lyme sykdomstester - hvordan de ser ut og hva er prisen på Lyme sykdomstester Western Blot test og Lyme sykdom. Tolkning av testresultatene Tick-borne sykdommer: Lyme sykdom, babesiose, bartonellose, TBE og andre.

For tiden er det mange modifikasjoner av PCR-metoden. For eksempel brukes i diagnosen Lyme borreliose hovedsakelig nestet PCR og sanntids PCR. Sistnevnte er en kvantitativ metode og tillater bestemmelse av nøyaktig antall Borrelia DNA-kopier i det testede biologiske materialet.

PCR (forskning) og Lyme sykdom

Serologiske tester er grunnlaget for diagnosen Lyme sykdom. Imidlertid er det kliniske situasjoner som kan føre til at disse testene er falske negative:

• serologisk vindu, dvs. den første infeksjonsperioden der kroppen ennå ikke produserer spesifikke IgM- og IgG-antistoffer mot Borrelia spirocheter
• hos personer med immunsvikt som ikke produserer nok antistoffer
• tilstedeværelsen av immunkomplekser som består av Borrelia spirochetes antigener og spesifikke antistoffer for dem og forhindrer påvisning av antistoffer ved serologiske metoder

Hvis det mistenkes symptomer på borreliose hos en pasient og serologiske testresultater er negative, kan det utføres molekylær testing basert på PCR-metoden.

DNA fra Borrelia spirochetes kan påvises i den tidlige fasen av infeksjonen, da antallet spirochetes i kroppsvæsker da er det høyeste.

Ved diagnosen Lyme borreliose brukes serologiske metoder som ELISA primært, men i noen kliniske situasjoner er genetiske tester med PCR-metoden nyttige.

Jo lenger tid fra infeksjon, desto mindre sannsynlig er det å oppdage bakterielt DNA. Derfor, i noen tilfeller, før PCR-testen utføres, dyrkes bakterier på spesialmedier i 1-2 uker, og deretter utføres testen.

Denne tilnærmingen brukes i tilfelle mistanke om borreliose og høstet cerebrospinalvæske. I den sene infeksjonsfasen er det mer hensiktsmessig å utføre en ELISA-test.

PCR-metoden bør ikke brukes i den rutinemessige diagnosen Lyme borreliose på grunn av manglende standardisering angående forekomst av Borrelia burgdorferi-varianter i Polen.

Imidlertid, i tilfelle diagnosevansker (spesielt i den tidlige fasen av sykdommen), hjelper resultatet av PCR-testen i diagnostisk prosess.

Et positivt testresultat betyr at tilstedeværelsen av Borrelia burgdorferi DNA og dets varianter ble oppdaget i det testede materialet, men det forklarer ikke om en aktiv infeksjon finner sted i kroppen. På den annen side utelukker et negativt resultat ikke tilstedeværelsen av bakterier i kroppen.

Noen laboratorier tilbyr testing for tilstedeværelse av Borrelia DNA i flåtten. Resultatet av en slik undersøkelse er imidlertid ikke grunnlaget for diagnosen Lyme-sykdom hos en bitt person.

Anbefalt artikkel:

ELISA-test - hva oppdager den? Hvordan lese resultatene? Prisen på testen

PCR - resultater. Kan de være falske positive?

PCR er en ultrafølsom metode og samtidig veldig følsom for forurensning. Derfor er det veldig viktig i PCR-baserte tester å velge en passende internkontroll for å utelukke falske positive.

Nøkkelen er også riktig samling av materiale for testing, samt erfaring og pålitelighet til diagnostikeren som utfører testen.

PCR - resultater. Kan de være falske negative

Som i enhver laboratorietest, også i PCR-metoden, kan falske negative resultater vises. Her er det avgjørende å samle blod for et passende antikoagulasjonsmiddel, da noen av dem, som heparin, kan hemme PCR-reaksjonen.

Også innsamling av materiale etter starten av antibiotikabehandling kan føre til en reduksjon i effektiviteten av PCR-reaksjonen og større sannsynlighet for falske negative resultater.

Det skal også huskes at Borrelia-bakterier lever veldig kort tid i blodet og kroppsvæskene, fordi takket være spesielle reseptorer trenger de veldig raskt inn i "vanskelig tilgjengelige" steder i kroppen.

Derfor, i motsetning til diagnostikken til andre mikroorganismer, er antallet Borrelia spirocheter i biologisk materiale lite, noen ganger til og med på deteksjonsgrensen for PCR-metoden. Dette kan også føre til falskt negativt.

Anbefalt artikkel:

Lymfocytt transformasjonstest (LTT)

Litteratur

1. Dunaj J. et al. Viktigheten av PCR-metoden i diagnosen Lyme borreliose. Bla gjennom Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Laboratoriediagnostikk av flåttbårne sykdommer. Anbefalinger fra arbeidsgruppen: National Chamber of Laboratory Diagnosticians, National Institute of Public Health-National Institute of Hygiene, National Consultant in the field of infectious sykdommer, Institutt for smittsomme sykdommer og nevroinfeksjoner, Medical University of Białystok, Polish Society of Virology, Warszawa 2014.
3. Ružić-Sabljić E. og Cerar T. Fremgang i den molekylære diagnosen Lyme sykdom. Ekspert Rev Mol Diagn. 2017 jan; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Prinsipper og anvendelser av polymerasekjedereaksjon i medisinske diagnostiske felt: en gjennomgang. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40 (1): 1-11.

Om forfatteren

Karolina Karabin, MD, PhD, molekylærbiolog, laboratoriediagnostiker, Cambridge Diagnostics Polska En biolog med spesialisering i mikrobiologi og en laboratoriediagnostiker med over 10 års erfaring i laboratoriearbeid. En utdannet ved School of Molecular Medicine og medlem av det polske samfunnet for human genetikk. Leder for forskningsstipend ved Laboratory of Molecular Diagnostics ved Institutt for hematologi, onkologi og indre sykdommer ved det medisinske universitetet i Warszawa. Hun forsvarte tittelen doktor i medisinsk vitenskap innen medisinsk biologi ved det første fakultet for medisin ved det medisinske universitetet i Warszawa. Forfatter av mange vitenskapelige og populærvitenskapelige arbeider innen laboratoriediagnostikk, molekylærbiologi og ernæring. På daglig basis, som spesialist innen laboratoriediagnostikk, driver han innholdsavdelingen ved Cambridge Diagnostics Polska og samarbeider med et team av dietetikere ved CD Dietary Clinic. Han deler sin praktiske kunnskap om diagnostikk og diettbehandling av sykdommer med spesialister på konferanser, treningsøkter og i magasiner og nettsteder. Hun er spesielt interessert i innflytelsen av moderne livsstil på molekylære prosesser i kroppen.